MIKROBIOLOGI METODE KULTUR

A.      PENILAIAN KEANEKARAGAMAN DAN BUDIDAYA

Pertumbuhan mikroba melalui proliferasi sel dapat dipisahkan dari aktivitas metabolik, tetapi ada pilihan untuk terjadinya budidaya sebagai indikator penting dan aktivitas mikroorganisme dalam ekosistem alam (Kell et al. 1998). Persyaratan untuk pertumbuhan itu sendiri tercermin di dua dari empat poin-poin penting yang digambarkan oleh dalil-dalil Robert Koch (1843-1910), yang dipercaya dengan menciptakan pengayaan budaya teknik dan budidaya beberapa patogen paling ampuh (Kell dan muda, 2000; Lihat kotak 3.1).

Pendekatan penelitian modern untuk menumbuhkan mikroorganisme yang diisolasi dari lingkungan alam banyak karya perintis dari Louis Pasteur (1822 – 95; (a)) yang paling dikenal untuk menunjukkan bahwa mikroorganisme tidak terjadi secara spontan yang dihasilkan dalam budaya kaldu cair. Karya Pasteur juga menjelaskan model terbaru gizi mikroba dengan menunjukkan perbedaan budaya ketika ragi dibudidayakan dalam berbagai kondisi aerasi.

Prinsip-prinsip pengayaan metode budaya yang dikembangkan oleh Robert Koch (1843-1910) masih berharga hari ini (b). Richard Julius Petri (1852-1921)  menemukan dimana-mana cawan petri saat bekerja di laboratorium Koch (Petri, 1887). Demikian pula, Fanny dan Walter Hess menemukan budidaya mikroorganisme pada media padat pada piringan agar, saat bekerja di laboratorium Koch (Hitchens dan Leikind, 1939). Gambar Koch direproduksi oleh milik Beste Grüsse di Wissenschaft der Museum, Jerman.

Morfologi koloni bakteri (c) Jamur berfilamen, (d) Dibudidayakan di piring agar berguna untuk penilaian awal keanekaragaman mikroba. Demikian juga, morfologi plak di perlihatkan oleh virus dibudidayakan dalam wadah yang sama untuk mikroorganisme yang berguna untuk penilaian awal virus. (e) Plak yang keruh, (f) Plak yang jelas.

Banyak ahli mikrobiologi masih menganggap budidaya sebagai standar emas dalam menilai fungsional karakteristik keanekaragaman mikroba (Palleroni, 1997; Watve dan Gangal, 1996). Para pendukung dari budidaya mengakui bahwa status budidaya mikroba saat ini di bawah kondisi laboratorium daun banyak yang harus diinginkan terhadap penilaian komposisi spesies dan kegiatan mereka dalam sampel lingkungan. Secara umum diasumsikan bahwa kurang dari 10% keanekaragaman mikroba yang ada di air, darat dan biologis dapat dipertanggungjawabkan oleh budidaya di bawah kondisi laboratorium (Barer et al., 1993; Barer dan Harwood, 1999; Kell et al. 1998). Untuk organisme yang dikultur, ada bukti tak terbantahkan dari perbedaan antara kegiatan mereka di alam dan kegiatan mereka di bawah kondisi laboratorium di mana pembentukan koloni didorong. Sebagai contoh, cyanobacterium diazotrophic (mampu menggunakan nitrogen atmosfer sebagai satu-satunya sumber nitrogen untuk pertumbuhan) spesies Trichodesmium mampu membentuk koloni di bawah kondisi laboratorium yang secara signifikan meningkatkan kemampuan organisme untuk melakukan reaksi yang tergantung pada nitrogenase, enzim oksigen-sensitif. Organisme ini sering diamati secara individual (seperti trikomatunggal) di lingkungan laut. Oleh karena itu, laboratorium penilaian berbasis koloni cenderung melebih-lebihkan kontribusinya terhadap nitrogen di alam (Letelier dan Karl, 1998).

Banyak usaha telah dilakukan untuk meningkatkan sensitivitas dari teknik-teknik yang dikembangkan untuk mengisolasi dan menumbuhkan mikroorganisme dari lingkungan alam (Biotol, 1992; Jaffal et al., 1997; Jensen et al., 2001; Tanner, 2002). Sebagian besar teknik berusaha untuk menyediakan kebutuhan nutrisi seimbang seperti sumber karbon dan elemen (Atlas, tahun 1995 and 1997). Hal ini juga diperlukan untuk mengoptimalkan parameter lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba, termasuk suhu, pH, tekanan oksigen, dan kelembaban. Bahkan ketika kondisi gizi dan lingkungan yang dioptimalkan untuk spesies tertentu, biasanya tidak mungkin untuk mereproduksi faktor lingkungan biotik yang menyediakan konteks yang penting untuk proliferasi mikroba di komunitas mikroba klimaks (Balows et al., 1991; Benlloch et al, 1996; Caldwell et al., 2002). Beberapa spesies mikroba diketahui memerlukan faktor pertumbuhan yang dihasilkan oleh proksimal tetapi berbeda spesies (Salyers dan Whitt, 2001). Selain itu, keberadaan spesies yang berbeda dalam jarak yang sangat dekat dapat menghasilkan kondisi lingkungan yang sangat bervariasi pada skala spasial yang sangat kecil. Variasi ini dapat memberikan pengaruh yang besar terhadap keanekaragaman organisme dalam habitat yang berbeda (Lihat gambar 3.1).

Gambar 3.1

Mengenai perbedaan tempat dalam faktor lingkungan cukup memberikan pengaruh pada distribusi keanekaragaman mikroba di jarak yang sangat kecil. (a) Fenchel (2002) menunjukkan gradien oksigen sangat curam mulai kurang lengkapnya oksigen ke jenuh pada 300% lebih dari jarak 2 mm di bagian vertikal atas 2 cm dari 1 m dalamnya sedimen laut di malam hari (A) dan siang hari (B). (b) pentingnya interaksi lintas-spesies nutrisi mikroba ditunjukkan oleh asosiasi antara tujuh sel bakteri sulfur hijau fotosintetik dipinggiran sebuah sel tunggal dari sebuah bakteri heterotrofik anaerobik. Dengan panjang tiang 0,5 µm.

B.       KULTUR AXENIC

Kultur axenic didefinisikan sebagai populasi homogen dari sel mikroba yang berasal dari satu spesies (Cummings dan Relman, 2002). Budidaya dalam budaya axenic atau murni menyediakan kesempatan unik untuk menyelidiki karakteristik fisiologi mikroba dan genetik tanpa pembatasan yang biasanya akan dikenakan oleh rendahnya  kepadatan penduduk dalam sampel lingkungan alam. Namun, sangat sedikit tentang mikroba ekologi dan keragaman sekilas dari budaya axenic karena adanya multiseluler heterogen mendominasi kehidupan mikroba di alam (Shapiro dan Dworkin, 1997). Studi tentang keanekaragaman bentuk mikroba dan fungsi telah mengungkapkan informasi penting tentang koloni morfologi, yang memberikan tingkat kepercayaan diri dalam spesifikasi klasifikasi sistematis. Namun, pemulihan mikroorganisme dan karakteristik morfologi koloni, tekstur, bentuk, warna dan ukuran, dikenal untuk mengubah sesuai dengan komposisi media dan inkubasi kondisi pertumbuhan (Stewart et al., 1995). Selain itu, budaya axenic adalah penggunaan terbatas dalam menilai keragaman mikroba karena sebagian kecil dari spesies mikroba yang telah dibudidayakan, dan variasi yang luas cultivability di kategori filogenik (gambar 3.2). Namun demikian, budaya axenic diperlukan untuk menghasilkan sel-sel dalam jumlah yang cukup untuk karakterisasi yang tepat dari fitur yang sistematis seperti analisis mikroskopis reaksi pewarnaan sel-terikat, yang dapat digunakan dengan cepat untuk membedakan antara spesies bakteri Gram-positif dan Gram-negatif (Gupta, 2002). Demikian pula, budaya axenic diperlukan untuk analisis mendalam dari profil molekuler yang dapat mengungkapkan informasi tentang hubungan filogenetik antara mikroorganisme (Von Wintzingerode et al., 1997). Kemajuan dalam memahami kebutuhan nutrisi mikroba dan kondisi pertumbuhan alami yang diperlukan untuk meningkatkan metode untuk pemulihan yang efesien dan budidaya organisme baru dan organisme hadir dibanyak habitat.

Gambar 3.2 proporsi perkiraan spesies bakteri dari berbagai kelompok filogenetik yang telah dibudidayakan mungkin mencerminkan bias dalam teknik isolasi mikroba yang tersedia dan teknik-teknik konservasi budaya (Colwell, 1997). Perkiraan berdasarkan metodologis perbandingan antara tanda tangan deteksi molekuler (16s RNA), kinetika DNA reassociation, dan kultur bakteri yang tersedia di deposit seperti koleksi budaya jenis Amerika (ATCC).

Æ        Pemodelan Gizi Mikroba

Asumsi umum bahwa mikroorganisme beradaptasi dengan baik untuk kedua kondisi lingkungan yang stabil dan berfluktuasi di habitat mereka itu menunjukkan bahwa ada kemungkinan untuk mereproduksi aspek fisik dan kimia dari habitat bahwa kondisi laboratorium untuk mendukung pertumbuhan mikroba. Oleh karena itu, simulasi lingkungan alam adalah langkah pertama dalam isolasi dan kultivasi mikroorganisme. Metode molekuler untuk menilai dampak dari status gizi pada biomassa mikroba dan struktur dalam komunitas situ telah memberikan konstribusi terhadap kondisi perkembangan pertumbuhan untuk mendukung budidaya laboratorium (White, 1993). Untuk mikroorganisme yang hidup bebas, media buatan, termasuk varietas padat dan cair telah diciptakan untuk mendukung budidaya bakteri dan jamur. Mewajibkan parasit intraseluler seperti virus  harus dibudidayakan pada sel tuan rumah mereka, dan deteksi mereka difasilitasi oleh produksi dapat terlihat dari zona yang jelas pada plak pada rumput monolayer terdiri dari sel inang. Meskipun prestasi yang luar biasa mereproduksi kondisi pertumbuhan alami selama ribuan mikroorganisme, pengakuan bahwa ada ribuan lebih banyak, mungkin jutaan, yang tidak berhasil dibudidayakan, ini adalah bukti kurangnya pemahaman yang komprehensif tentang gizi mikroba sebagai integrasi biotik kompleks dan parameter lingkungan abiotik. Untuk virus, identifikasi sel inang dan karakterisasi kerentanan kondisi sel inang tidak selalu cukup untuk mereproduksi virus proliferasi di bawah kondisi laboratorium karena kesulitan yang dihadapi dalam pemodelan interaksi antara dua jenis organisme. Namun, untuk organisme yang hidup bebas, termasuk pada prokariota, itu pertama untuk menganalisis komposisi kimia dari sel untuk model kondisi lingkungan yang dapat mendukung pertumbuhan dan proliferasi.

Dalam keadaan pertumbuhan mereka vegetatif normal, sel-sel yang hidup bebas sebagian besar terdiri dari air (berat 70-85%), hingga 15% dari protein sebagai enzim dan struktur molekul, 7% dari bahan polimer seperti polisakarida yang membentuk dinding sel, 3% dari lipid, 3% dari RNA, dan 1% dari DNA. Selain itu, komposisi unsur sel mikroba meliputi 50% karbon, 20% oksigen, 14% nitrogen, 8% hidrogen, 3% fosfor, 1% belerang, 1% kalium, 0,5% kalsium, 0,5% magnesium, dan 0,2% besi. Mengingat komposisi selular ini, tampaknya masuk akal untuk memenuhi kebutuhan pertumbuhan dengan persiapan yang cermat dari media kultur untuk mendukung pertumbuhan sel dan proliferasi. Pada kenyataannya, konsentrasi yang sangat kecil membatasi nutrisi dan faktor pertumbuhan yang tidak ditemukan di semua lingkungan yang bertanggung jawab untuk mengendalikan laju pertumbuhan mikroba, dan untuk memilih jenis spesies yang dapat bertahan hidup di lingkungan tertentu.

Æ        Sistem Trofik Mikroba

Pertumbuhan mikroba didukung oleh tiga kategori utama nutrisi, yaitu sumber energi, sumber karbon dan elemen. Sumber energi termasuk bahan-bahan yang menghasilkan adenosin trifosfat (ATP) melalui berbagai bentuk respirasi atau fermentasi, tergantung pada ketersediaan relatif mengoksidasi dan mengurangi alat. Sumber karbon yang diperlukan untuk konstruksi biomassa, dan unsur elemen yang diperlukan untuk kegiatan biokimia khususnya untuk mengoptimalkan, sebagai contoh, proses enzimatik. Sebagian besar media pertumbuhan yang dikembangkan untuk budidaya mikroorganisme berisi jumlah yang seimbang dari air, sumber karbon, sumber energi, nitrogen, belerang, fosfor, kalium, magnesium, kalsium, molekul oksigen, elemen dan faktor pertumbuhan organik. Elemen umumnya antara logam kofaktor kobalt, tembaga, besi, mangan, molibdenum dan seng. Elemen tambahan termasuk asam amino esensial mungkin diperlukan untuk beberapa organisme tertentu yang tidak mampu mensintesis senyawa de novo.

Æ        Aerasi

Prokaryota telah disesuaikan dengan pertumbuhan di bawah konsentrasi yang berbeda dari bahan kimia atmosfer, dan sebaliknya, konsekuensi dari pertumbuhan mikroba berkontribusi modifikasi komponen atmosfer. Mikroorganisme terus mengubah udara bumi melalui keterlibatan mereka dalam oksidasi biokimia dan proses pengurangan (redoks) untuk mendukung trantai transpor elektron menghasilkan energi. Ada empat kategori mikroba interaksi dengan molekul oksigen yang diakui. Anaerob obligat telah ditemukan dalam lingkungan buatan dan alami dengan akses terbatas ke gas, atau dalam situasi di mana oksigen dengan cepat dikonsumsi oleh proses biologi dan kimia. Organisme anaerobik juga dapat bertahan dalam lingkungan aerasi jika mereka tidak aktif secara metabolik, karena produk sampingan beracun oksigen metabolisme diproduksi hanya selama pengangkutan elektron yang aktif.

Antara situasi yang ekstrim organisme aerobik dan anaerobik obligat yang mikroaerofilik dan organisme Heterofermentatif anaerobik. Mikroaerofil membutuhkan molekul oksigen untuk pertumbuhan tetapi menunjukkan efek toksisitas oksigen pada konsentrasi yang mendekati tingkat oksigen atmosfer kontemporer. Anaerob fakultatif dapat tumbuh baik di hadapan dan tidak adanya molekul oksigen karena mereka mampu menggunakan bahan kimia alternatif sebagai akseptor elektron dalam reaksi redoks ( Tanner, 2002). Salah satu perbedaan penting antara aerob dan anaerob adalah produksi enzim seperti katalase dan superoksida dismutase digunakan oleh aerob untuk detoksifikasi produk sampingan dari metabolisme oksigen, yaitu hidrogen peroksida dan superoksida, masing-masing.

Æ        Karbon dan Sumber Energi

Mikroorganisme dibedakan berdasarkan preferensi mereka untuk substrat karbon dan sumber energi. Autotropisme dan heterotropisme mengacu pada kemampuan organisme untuk menggunakan bentuk-bentuk organik atau anorganik karbon, masing-masing; Sedangkan fototropisme dan chemotropisme merujuk pada kemampuan untuk menggunakan cahaya atau bahan kimia sebagai sumber utama energi, masing-masing (Zelenev et al., 2000; Lihat gambar 3.3).

      Catatan, organisme yang menunjukkan kedua autotrophy dan heterotrophy juga disebut mixotropis

           Gambar 3.3 Mikroorganisme dapat dikalsifikasikan sesuai kategori gizi berdasarkan preferensi untuk substrat karbon dan pembangkit energi. Organisme dilengkapi dengan molekul pengumpulan cahaya array (Photosistem (PS) I atau Photosistem (PS) II) dapat menggunakan sinar matahari sebagai sumber energi. Mikroorganisme lainnya mengkhususkan diri dalam menggunakan senyawa anorganik (lithothrofik) atau organik (organotrofik). Sumber karbon, organisme autotrofik menggunakan karbon dioksida, dan yang lainnya heterotrofik.

Mikroorganisme autotrofik berada di dasar rantai makanan karena kemampuan mereka untuk menggunakan karbon dioksida untuk mensintesis senyawa karbon yang lebih kompleks daripada substrat. Mikroorganisme yang menggunakan cahaya untuk menghasilkan energi dan karbon dioksida untuk membangun biomassa "fotoautotrofik". Sebaliknya, mikroorganisme heterotrof menggunakan senyawa non-karbon dioksida sebagai sumber karbon untuk mendukung pertumbuhan. Organisme yang menggunakan sumber cahaya dan non-karbon dioksida karbon "fotoheterotrofik". Berbeda dengan mikroorganisme fotoautotrofik, mikroorganisme fotoautotrofik tidak dapat menggunakan karbon dioksida sebagai sumber utama dari karbon, dan mereka tidak dapat menghasilkan oksigen. "Chemoautotrophic" organisme menggunakan senyawa kimia sebagai donor elektron untuk produksi energi, tapi mereka bergantung pada karbon dioksida untuk membangun biomassa berbasis karbon. Mikroorganisme Chemoheterotrophic menggunakan senyawa kimia untuk produksi energi dan senyawa organik sebagai sumber biomassa-bangunan karbon. Sebagai contoh, beberapa organisme chemoheterotrophic dapat menggunakan glukosa untuk sumber-sumber energi dan karbon.

Æ        Kondisi Pertumbuhan Selektif

Media pertumbuhan selektif untuk kondisi inkubasi selektif telah berhasil digunakan untuk mempersempit ruang lingkup spesies dari komunitas mikroba. Selektivitas didasarkan pada pengakuan bahwa mikroorganisme beradaptasi dengan faktor fisikokimia gizi yang tidak semestinya (Wu dan Chen, 1999). Sebagai contoh, banyak mikroorganisme dapat berkembang biak di pH netral 7.0, tetapi sangat "alkalifilik" mikroorganisme dapat dipilih dengan mempertahankan pH media pertumbuhan lebih dari 10,0 (Horikoshi dan Akiba, 1982; Matthies et al., 1997). Pertumbuhan mikroba selektif tersebut juga dapat dikontrol dengan mengatur suhu inkubasi, dengan berbagai macam toleransi mulai dari kurang dari 0° C ("psychrofilik" organisme) untuk lebih tinggi dari 100° C ("thermophilic" organisme) (Zdanowski dan Weglenski, 2001). Tekanan udara, konsentrasi garam, antibiotik, dan kondisi cahaya adalah strategi lain untuk memilih pertumbuhan mikroba dalam budaya axenic. Dalam penilaian keanekaragaman mikroba, tidak mungkin untuk mereproduksi semua kondisi lingkungan yang mungkin untuk memfasilitasi pemulihan semua organisme.

C.       KULTUR MIKROKOSMOS

Proses Mikrobiologi yang konsekuensi untuk fungsi ekosistem global dapat digambarkan sebagai reaksi kimia yang seimbang, yang dikatalisis oleh enzim. Hal ini tidak biasa untuk mengisolasi organisme dari lingkungan untuk menanyakan apakah peran mereka dalam proses ekologi skala besar dapat direproduksi dalam budaya axenic. Percobaan tersebut biasanya meremehkan atau melebih-lebihkan kontribusi dari mikroorganisme yang hidup bebas karena kegiatan mereka di alam selalu dipengaruhi dengan kehadiran kelompok organisme lain (Slater et al., 1983; Staley et al., 1997). Banyak upaya telah dilakukan untuk menangkap kegiatan dari komunitas mikroba melalui penggunaan teknik budidaya khusus (Christensen et al., 2002). Budaya komunitas mikroba berbeda dari budaya populasi campuran, yang dihasilkan dengan menggabungkan dua atau lebih budaya murni sementara tidak termasuk organisme lain dengan meninkubasi campuran dalam kondisi aseptik (Caldwell et al., 2002).

Budaya mikrokosmos telah memungkinkan penyelidikan tentang bagaimana perubahan proses ekosistem tertentu yang disertai dengan perubahan dalam keragaman mikroorganisme (Muller et al., 2001; Radajewski et al., 2000). Hasil penyelidikan tersebut telah memberikan kontribusi untuk pengembangan model teoritis yang digunakan untuk menggambarkan interaksi di antara spesies yang berbeda. Misalnya, "model kompetisi" menyatakan bahwa masyarakat muncul melalui persaingan antara individu atau kelompok organisme. Sebaliknya, "model kerjasama" menunjukkan bahwa masyarakat muncul melalui koperasi interaksi yang memaksimalkan pemanfaatan sumber daya yang tersedia dan spesialisasi kedudukan yang sesuai. "Model proliferasi" menunjukkan bahwa masyarakat hasil dari pertumbuhan bersarang seri organisme berkembangbiak daripada melalui kompetisi specific atau kerjasama (Caldwell et al., 2002). Aplikasi praktis dari data yang dikumpulkan melalui mikrokosmos tersebut memerlukan pengetahuan lanjutan keanekaragaman mikrobial intrinsik dalam sampel lingkungan, dan informasi rinci mengenai kondisi lingkungan yang mempengaruhi perkembangan komunitas mikroba klimaks (Liu et al., 2001). Strategi mikrokosmos lain untuk menumbuhkan komunitas mikroba termasuk penggunaan chemostats, nutristats, dan microstats untuk terus-menerus propagasi kompleks komunitas mikroba (Veldkamp, 1976; Willke dan Vorlop, 1994; Wimpenny, 1998).

• Kolom Winogradsky telah digunakan secara luas untuk menunjukkan keragaman metabolisme prokariotik. Proses kolom mandiri yang didorong oleh energi cahaya, dan itu menggambarkan saling ketergantungan antara berbagai mikroorganisme yang berbeda dalam mempertahankan keseimbang dari unsur-unsur dalam skala kecil. Kolom kaca, tinggi sekitar 30 cm dan diameter 5 cm, yang diisi sampai kedalaman sepertiga dengan danau atau Sungai sedimen dilengkapi dengan sumber karbon (misalnya kertas selulosa), natrium sulfat, dan kalsium karbonat. Kolom ini kemudian diisi ke atas dengan sampel air lingkungan. Tabung dibatasi dan ditempatkan di dekat jendela dengan cahaya tambahan. Budaya komunitas mikroba berkembang selama 2 – 3 bulan inkubasi selama sel-sel berkembang biak dalam jumlah yang rendah, dan spesialisasi ceruk diamati melalui pengembangan zona pigmentasi yang berbeda. Dalam kolom, dimungkinkan untuk mengisolasi mikroorganisme yang mewakili masing-masing dari empat bentuk dasar metabolisme energi dan karbon: fotoautotropis, chemoheterotropis, fotoheterotropis, dan chemoautotropis (a). Angka (b)–(e) mewakili reaksi biogeokimia yang berlangsung di kolom seperti yang dilakukan oleh empat kategori utama aktivitas metabolisme. PS I dan PS II mewakili otosistems I dan II, masing-masing. Diagram skematik direproduksi oleh milik Joseph Vanillo, Laboratorium Biologi Kelautan, Woods Hole, MA.

D.      SOMNICELL DAN PENILAIAN KEANEKARAGAMAN MIKROBA

Beberapa peneliti telah menemui kesulitan kultur mikroorganisme tampaknya layak dalam berbagai ekosistem. Ada peningkatan kesadaran bahwa "layak tapi nonculturable" (VBNC) mikroorganisme mewakili keadaan umum organisme dalam lingkungan alam (Colwell dan Grimes, 2000; Kaprelyants et al., 1993). Terminologi lain yang digunakan untuk menggambarkan sel-sel VBNC termasuk "somnicells" dan "aktif non-sporulasi" mikroorganisme (kotak 3.3).

·      Di alam, sel mikroba bisa eksis di salah satu dari empat fisiologis negara, yang mempengaruhi kemampuan mereka untuk membentuk koloni terlihat pada isolasi dan upaya budidaya. Tiga dari empat fisiologis negara merupakan organisme yang layak dan kulturable yang dapat ada vegetatif, aktif atau terluka. Organisme ini bahkan dapat membentuk koloni seperti yang diamati di bawah budidaya laboratorium. Isolasi, pencacahan, atau identifikasi organisme dalam keadaan vegetatifyang normal hanya memerlukan penyediaan kondisi pertumbuhan yang memadai, termasuk nutrisi, parameter lingkungan kimia-fisika dan interaksi ekologi yang diperlukan. Dalam keadaan tidak aktif, yang dapat dipicu oleh kurangnya nutrisi atau kondisi lingkungan yang ekstrim, mikroorganisme dapat diresusitasi dengan mengembali mereka ke kondisi normal gizi dan lingkungan yang mendukung pertumbuhan. Dalam keadaan terluka, sel-sel yang rusak oleh paparan bahan kimia beracun atau kondisi lingkungan yang keras, tetapi mereka dapat diresusitasi di media pertumbuhan buatan setelah periode berlarut-larut perbaikan kondisi lingkungan yang mendukung. Keempat di mana mikroba yang ada di alam merupakan mikroorganisme non-culturable, yang terbukti aktif secara metabolik terbukti. Organisme ini tidak dapat dikultur baik karena media pertumbuhan buatan tidak memadai, atau karena konsorsium mikroba diperlukan untuk pertumbuhan. Organisme non-culturable juga dapat metabolik aktif dan non-culturable tidak aktif, keadaan yang sulit untuk membedakan dari mati.

·      Konsep mikroorganisme VBNC dikembangkan dari perspektif sel-sel individual, dan dengan demikian, dampak dari negara non-culturable pada perhitungan kepadatan populasi organisme yang dikenal cukup besar. Hal ini karena dalam populasi tertentu dari sel miliki spesies tunggal, itu sangat mungkin bahwa sebagian kecil dari jumlah sel-sel tidak akan membentuk koloni berdasarkan menjadi sasaran metode budaya. Namun, sangat sedikit informasi telah disumbangkan oleh konsep VBNC untuk pemulihan spesies baru yang belum pernah dibudayakan karena setiap sel miliki spesies yang diduga berada dalam keadaan non-culturable. Dalam kasus tersebut, alasan yang paling mungkin untuk sebagian kecil yang relatif kecil jenis mikroba yang ditemukan oleh lingkungan, dibandingkan dengan informasi yang tersedia di Keragaman genetik, adalah bahwa metode budaya yang tidak memadai atau bahwa beberapa sel mikroba yang ada dalam keadaan alami simbiosis interaksi dengan sel-sel yang milik spesies lain sehingga sel-sel individu tidak dapat membentuk independen koloni. Fenomena ini sebagian dapat menjelaskan ketidakmampuan pengayaan budaya teknik dipelopori oleh Martinus Beijerinck (1851 – 1931) untuk menunjukkan dimensi geografis keanekaragaman mikrobial (Azofsky, 2002; Finlay, 2002). Diagram didasarkan pada model yang telah dijelaskan oleh Kell dan muda, 2000

Keberadaan sel-sel tersebut adalah kekhawatiran upaya untuk secara kuantitatif memperkirakan keanekaragaman mikrobial, tetapi ada beberapa kontroversi atas terminologi yang tepat untuk digunakan, dan interpretasi yang benar dari pertemuan dengan bebas-cultivability sel-sel di alami masyarakat mikroba (Barer et al., 1993; Barer dan Harwood, 1999; Kell dan muda, 2000; Kell et al. 1998). Selain itu, ada kurangnya data pada apakah fenomena VBNC mempengaruhi perkiraan keragaman yang telah disajikan untuk non-bakteri mikroorganisme (Azofsky, 2002; Colwell, 1996; Finlay et al, 1996). Fenomena lebih rumit oleh beberapa kebingungan tentang perbedaan antara negara VBNC dan status mikroorganisme yang bertahan lingkungan yang keras melalui induksi perubahan yang memfasilitasi tahan banting dan penyebaran (Kwaasi et al. 1998; Mandeel et al., 1995).

Pendekatan inovatif untuk "kebangkitan" spesies sebelumnya tak berbudaya adalah penggunaan ruang difusi yang diciptakan untuk mensimulasikan kondisi gizi dan lingkungan alam di laboratorium. Ketika diinokulasi dengan sampel lingkungan seluruh, Ruang difusi dapat mengatasi beberapa keterbatasan yang disebabkan oleh ketidakmampuan untuk mereplikasi kondisi pertumbuhan alami yang mendukung pembentukan koloni di laboratorium (Kaeberlein et al., 2002; Gambar 3.4). Sebagian besar spesies pulih dengan cara ruang difusi tidak ada sebagai budaya murni media buatan, tetapi mereka mampu membentuk koloni di hadapan organisme lain. Pengamatan ini sangat menunjukan bahwa fenomena VBNC dapat dijelaskan sebagian oleh kebutuhan untuk faktor pertumbuhan yang dihasilkan biologis di media tumbuh paling sintetis.

Gambar 3.4 penggunaan ruang pertumbuhan difusi untuk budidaya in situ lingkungan mikroorganisme berjanji untuk mengurangi jumlah kasus di mana "layak tetapi non-culturable" penjelasan digunakan untuk karakterisasi miskin keanekaragaman mikroba. Ruang difusi dibentuk oleh cincin penutup yang ditempatkan antara dua penyaring polikarbonat  dengan ukuran pori-pori 0,03 mikrometer (bingkai A di (a)). Beberapa ruang pertumbuhan difusi dapat diinkubasi dalam format susunan langsung di lingkungan untuk memulihkan koloni mikroba di penyaringan (bingkai B dalam (a)). Pendekatan ruang difusi telah digunakan untuk memulihkan spesies mikroba baru dari sedimen laut (Kaeberlin et al., 2002). Pengamatan mikroskopis koloni yang dikembangkan pada saringan menunjukkan keragaman morfologi koloni (bingkai A, (b), kanan). Fenomena VBNC dalam kasus khusus ini mungkin dipengaruhi oleh variasi musiman seperti yang ditunjukkan oleh pertumbuhan pemulihan dalam ruang difusi selama beberapa bulan (bingkai B, (b), kanan). Sel-sel yang memanjang di koloni baru sedimen laut diidentifikasi sebagai MSC1 ditunjukkan dalam koloni-koloni bingkai C. MSC1 koloni yang terbentuk pada kasein agar hanya di hadapan spesies lain, MSC2 (bingkai D, magnified tampilan dalam bingkai E).

DAFTAR PUSTAKA

Ogunseitan, Oladele. 2005. Microbial diversity. Blackwell Publishing.